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公元前480年，波斯国王薛西斯一世（罗德里戈·桑托罗 饰）率30万大军入侵 希腊 。斯巴达国王列奥尼达（杰拉德·巴特勒 饰）奉命守温泉关，率300精兵与联军4000余人迎敌。他与妻子戈戈（琳娜·海蒂 饰）诀别，携副将迪利奥斯（大卫·文翰 饰）出征。波斯使者威胁斯巴达臣服，列奥尼达断然拒绝，杀使者宣战。面对波斯先锋、战象、精锐不死军，斯巴达勇士凭借地形与方阵，浴血奋战，杀敌无数。列奥尼达拒绝畸形人埃菲阿尔特（安德鲁·蒂曼 饰）的投靠，局势却因内忧外患而恶化。

叛徒出卖，希腊联军被波斯军抄后路，列奥尼达为保存联军实力，遣散盟友，独率300勇士死守温泉关。两日激战，斯巴达军全员阵亡，毙敌超两万，薛西斯一世的两位兄弟亦战死。迪利奥斯奉命撤回，传递列奥尼达的遗志。温泉关的牺牲震慑波斯，却埋下复仇的种子，希腊的命运仍悬而未决。